Молекулярная диагностика: пцр в реальном времени

В настоящее время в молекулярной диагностике разработан механизм полимеразной цепной реакции (ПЦР), что стало толчком для развития большого количества методов диагностики заболеваний, основанных на определении генетического материала. Для проведения ПЦР в реальном времени используется фрагмент гена (в частности нуклеиновой кислоты) возбудителя заболевания, который не встречается у иных особей.

Видео: Мастер-класс "Методы молекулярной биологии. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)"

Принцип ПЦР заключается в размножении определённого фрагмента ДНК возбудителя в миллионы раз при помощи ДНК-полимеразы в специальном аппарате, именуемом термоциклером, который обеспечивает циклическое повторение температурного режима по заданной программе.

Диагностика ПЦР даёт возможность повторять ряд амплификаций, сохраняя активность фермента. Когда амплификация проходит беспрепятственно, за один цикл количество копий определённого участка ДНК возбудителя возрастает вдвое, после тридцати циклов – в сто десять раз. Именно поэтому ПЦР используется в диагностике для определения достаточно маленьких патогенных организмов, выявление которых без этого невозможно.

Видео: Диагностика ортопоксвирусов

Следует отметить, что РНК не может быть матрицей для ПЦР в реальном времени. Поэтому, для того, чтобы обнаружить вирусную РНК, перед амплификацией нужно получить ДНК, соотносящуюся с соответствующим её фрагментом. Полимеразная цепная реакция даёт возможность производить измерения ДНК и РНК возбудителя. Полученная таким образом информация используется для проведения наблюдения за эффективностью используемой терапии, а также оценки клинического прогноза.

Кроме того, ПЦР в реальном времени не нуждается в дополнительных действиях относительно расшифровки исследуемой ДНК или ампликонов, которые служат барьером для постановки правильного диагноза и приводят к получению ложных результатов. Данный подход позволяет не использовать стадию электрофореза, что ведёт к снижению риска заражения продуктами полимеразной цепной реакции. Также, в связи с уменьшением количества проводимых манипуляций с возбудителем, сокращается время проведения исследования, упрощается его процесс, снижается вероятность возникновения ошибок. Также ПЦР позволяет определить исходное количество копий ДНК возбудителя в клинической пробе, что помогает выявлять периоды обострений заболеваний и принимать своевременные меры для излечения пациента.

На сегодняшний день существует большое количество методов фиксации амплификации в реальном времени. Наиболее часто используются различные методики, применяющие соотносящиеся с ампликоном флуорогенные зонды, интенсивность излучения которых меняется в зависимости от накопления ампликона и записывается в реальном времени при помощи специального прибора, именуемого амплификатором с оптическим модулем. Это обеспечивает высокий уровень чувствительности проводимого анализа. При этом продукт ПЦР может быть обнаружен наряду с огромным количеством побочных продуктов, в то время, когда при использовании электрофореза он в частых случаях не замечается.

При ПЦР в реальном времени используют положительные, контрольные и отрицательные образцы. Так, положительные и отрицательные образцы при проведении исследования анализируются как отдельные пробы, контрольный образец при этом вносится в каждую такую пробу и проходит все этапы анализа.

На сегодняшний день существует большое количество приборов для проведения полимеразной цепной реакции. К ним можно отнести Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid или Roche. Каждый из них имеет достоинства и недостатки

Следует отметить, что ПЦР - метод диагностики, используемый в крупных научных, исследовательских и диагностических центрах различных стран мира, поскольку даёт возможность проводить мгновенную интерпретацию полученных результатов.